蛋白质及其复合物、组装体完整三维结构的测定,是研究生命活动中分子结构与功能之间关系,并揭示生命现象物理化学本质的科学基础。目前,生命科学的主要目的是揭示基因组的功能,并在此基础上阐明遗传、发育、进化、功能调控等基本生物学问题,以及进一步解决与医学、环境保护、农业密切相关的问题。由于基因的功能最终将通过其表达产物即蛋白质来实现,因此,要了解基因组全部功能活动(包括正常的和异常的),最终也必须回到蛋白质分子上来。蛋白质的主要功能则取决于其三维结构,目前,X射线晶体法是最常用的解析蛋白质三维结构的手段,该方法成功与否取决于是否可以得到高质量的蛋白质单晶。蛋白质结晶过程是蛋白质分子从无序变为有序,从而从溶液中析出成为晶体的过程。由于蛋白质分子之间相互作用千差万别、蛋白质晶体产生条件荀刻,导致大量与人类、植物等相关的重要蛋白质难以结晶,从而无法得知其结构并对其功能进行研究为了得到高质量的晶体,研究者致力于开发异质成核剂以促进蛋白质产生晶体并且已经取得一定的成果,但是由于这些成核剂对蛋白质缺乏特异性亲和能力,导致结晶实验成功率低,且随机性大。因此,开发一种与蛋白质具有高度亲和性、普适的成核剂材料非常关键。

　　蛋白质磷酸化修饰是非常重要的一种蛋白质翻译后修饰,迄今发现的所有蛋白质中超过50%均可被磷酸化修饰。蛋白质磷酸化作为一种重要的蛋白质翻译后修饰方式,几乎与机体的所有生命活动有关,在控制细胞生存进程中起着关键作用,这些进程包括:细胞循环、生长、分化和凋亡等在植物体中,蛋白质的可逆磷酸化与植物抵抗外界环境胁迫有关,如抵抗病原菌侵害、抗寒、抗旱、抗盐等。目前,对于植物的研究主要局限在模型植物拟南芥等特定激酵的憐酸化进程上作为自然界广泛存在的生物,植物与人类的关系密不可分,磷酸化蛋白质组学领域的研究非常必要。然而蛋白质磷酸化是一个高度动态变化的过程,而且具有低化学计量、低丰度的特点,这些特点导致蛋白质磷酸化分析非常具有挑战性。此外,由于植物细胞中含有大量的细胞壁等组织,以及植物叶片中大量存在的核酮糖等干扰物质,导致植物憐酸化蛋白质极难分离,从而给植物磷酸化蛋白质的研究造成很大障碍,因此,发展一种高效地植物憐酸化蛋白质分离手段非常重要已经建立起来的磷酸化蛋白质/多肽富集方法主要分为三类,即免疫沉淀法、化学衍生法和亲和色谱法,在这三类方法中,免疫沉淀法是用来富集磷酸化蛋白质,而另外两种方法均是用来富集憐酸化多肽。免疫沉淀法是利用磷酸化蛋白质上的磷酸化残基与抗体之间的特异性结合,从而将憐酸化蛋白质从样品中分离出来的一种方法,利用这种方法,一些酪氨酸位点磷酸化的蛋白质被鉴定出来,例如等刺激因子。这种方法的最大缺点是,对于发生丝氨酸和苏氨酸_酸化的蛋白质,因为得不到相应的抗体,几乎没有办法富集,虽然现在也有一些通过该方法富集得到丝氨酸鳞酸化的蛋白质。

1.固定金属离子亲和色谱材料

　　1975年,首次在蛋白质分离中引入固定金属离子亲和色谱法(IMAC),并在随后的研究中大力推进该方法的发展。在随后的十年里,关于在蛋白质或者多肽分离中应用IMAC技术的文章数量飞速发展,目前,IMAC在磷酸化多肽领域的研究主要集中在两个方面,一是IMAC材料的制备,二是吸附和解及附缓冲液的优化。在IMAC材料的制备部分主要有三个关键点,即基质、整合基团、金属离子,对于现有MAC材料各部分的选择,亚氨基二乙酸和次氮基三乙酸的应用相对较广,与之相对应的金属离子为Fe3+和Ga3+,对于基质来说,琼脂糖、纤维素、二氧化桂的应用较为广泛,而且已经有商品化的产品,但是大量实验表明,以这些材料为基础的IMAC在鳞酸化多肽的富集过程中,缺乏足够的专一性,在富集磷酸化多肽的同时会吸附大量的酸性非磷酸化多肽(主要是含有大量梭基的多肽),为了避免这种非特异性吸附现象的发生,美国Viginia大学的White小组在采用IMAC对磷酸化多肽进行富集前,首先对样品进行羧基的化反应,从而降低酸性非磷酸化多肽的吸附,但是由此带来的副反应以及反应不完全均会对样品造成污染,进而使得后续质谱检测的灵敏度降低。除了将MAC制备成常规的小球外,复旦大学的原教授研究小组、军事医学科学院的钱小红研究小组等将MAC做成带有磁性的载体,基本原理是利ffiFe304@C材料,在其外壳改性并且固定金属离子,从而得到具有磁性的IMAC,因为材料具有磁性,所以在分离时非常方便。

　　MAC材料制备之后,需要对其富集过程中釆用的缓冲液体系进行优化,从而降低酸性非磷酸化多肽的非特异性吸附。已经有研究表明缓冲液的组成、pH值的细微改变均会对最终的富集效果产生影响不仅在材料方面做了深入的研究,在缓冲液的选择上也做了大量研究,在其对洗脱缓冲液体系进行优化时,发现磷酸和乙腈的混合液可以取得非常好的洗脱效果。IMAC法不论是在材料还是在缓冲液的选择性,近年来都取得了很大进展。

2.分子印迹材料

　　印迹材料的概念于1931年被Polyakov首次提出,但是直到20世纪80年代,关于分子印迹技术的研究依然处于空白期。分子印迹属于超分子化学研究范畴,是指以某一特定的目标分子为模板,制备对该分子具有特异选择性材料的过程,该技术被描述为可以识别“分子钢匙”的“人工锁”技术。分子印迹技术一般分为三个步骤:1)模板分子与功能单体在溶剂中通过共价或非共价相互作用形成稳定的复合物;2)加入交联剂和引发剂,在紫外光或热引发下发生聚合作用,使得模板分子周围形成高度交联的刚性聚合物;3)通过水解或萃取的方法将模板分子洗脱,从而在聚合物中留下了与模板分子的大小、形状及功能基团相匹配的空穴。目前,全世界至少有包括瑞典、日本、德国、美国、中国等在内的几十个国家、上百个学术机构和企事业团体在从事分子印迹材料的研究和开发。在过去的20年里,有关分子印迹技术的研究飞速发展,分子印迹技术的潜力被逐步挖掘出来,应用领域也越来越广泛。分子印迹技术发展如此迅速,主要因为它有三大特点:构效预定性、特异识别性和广泛适用性。基于该技术制备的分子印迹材料具有亲和性和选择性高、抗恶劣环境能力强、稳定性好、使用寿命长、应用范围广等特点,欧盟委员会早在1998年已经启动了一项专门自主欧洲8个研究小组从事印迹材料的制备、结构表征,以及分子印迹材料用于临床分析、环境分析以及生物分析等方面的研究。

　　目前,分子印迹技术在小分子领域的应用已经非常成熟,然而,对于复杂的生物大分子的研究依然匮乏,虽然已经有研究报道将分子印迹技术应用到蛋白质、DNA、甚至病毒的研究上，但是在蛋白质、微生物细胞等生物大分子的应用上依然处于起步阶段。按照合成方法进行分类,分子印迹聚合物可以分为以下几类:本体聚合、悬浮聚合、沉淀聚合、表面分子印迹以及抗原印迹技术等。本体聚合是最为常见的一种分子印迹聚合物合成方法,合成时,将功能单体及模板分子溶解在同一种溶液中,交联后对材料进行干燥、研磨、蹄分、模板分+洗脱,从而得到粒径处于一定范围的分+印迹聚合物。已经被应用在毛细管屯泳、高效液相色谱以及薄层色谱中。但是由于通过该方法合成的分子印迹聚合物需要进行研磨,将导致产物颗粒不均一、人量高亲和键合位点被破坏以及模板分-f洗脱不彻底的问题,因此大大限制了该方法的应fH。为了更好地应用分子印迹技术,许多其它的合成方法被建立。悬浮聚合是将模板分子、功能单体以及交联剂溶解丁?有机溶剂中,然后移入水溶液中进行搅拌、乳化,之后引入引发剂引发聚合反应的发生,最后通过干燥、模板分子洗脱,可以得到粒径相对均的多分散分子印迹聚合物。

　　表面分子印迹是指在分子印迹聚合物制备的过程中,将结合位点限在表面,模板分子的洗脱和再结合均发生在表面,因此非常适合对丁?生物大分子的印迹。通常,表面印迹是在微球载体表面进行修饰或涂层制备得到,制备过程中,功能单体与印迹分子在乳液界面处结合,交联剂与单体聚合后,这种结合物结构就印在了聚合物的表面。抗原印迹技术是表面分子印迹技术的一种,是根据自然界中抗原与抗体之间特异性的相互作用而建立的一种方法,采用目标蛋白质分子暴露在表面的特征肽段(抗原决定基)作为模板分子,制备得到不仅可以识别模板分子,同时也可以识别以模板分子为特征部位的蛋白质分。该技术的引入为制备新型蛋白质分子印迹材料提供了新思路。

3.固定钛离子亲和色谱材料的制备及应用

　　蛋白质翻译后修饰在蛋白质加工、成熟的过程中发挥着重要作用,它可以改变蛋白质的物理、化学性质,影响蛋白质的空间构象、立体位阻及稳定性。可逆蛋白质磷酸化是蛋白质翻译后修饰中最为广泛的一种,其在细胞代谢、增殖、分化、蛋白质降解、细胞信号传导等生理过程的调控中发挥重要作用。在植物体内,可逆蛋白质憐酸化与植物抵抗外界环境胁迫有着密切关系,这些胁迫主要有生物或者非生物胁迫,如盐胁迫、激素胁迫、温度胁迫等等。对植物来说,盐胁迫是最为广泛的一种胁迫方式,有研究报道,在未来10年,盐胁迫将影响50%的植物。为了抵抗外界环境的威胁,植物体已经进化出一套高度精细的信号感知、传导以及细胞反应网络。在这个网络中,可逆蛋白质磷酸化进程起到的关键的作用。在我国,玉米是一种主要的粮食作物,关于其抵抗外界盐胁迫条件下的磷酸化蛋白质组学的研究,将有助于人们认清植物抵抗盐胁迫的机理,并为开发抗盐胁迫的品种提供理论依据。目前,在植物磷酸化蛋白质组学领域已经取得一些进展,但是这些研究对象主要集中拟南芥、水稻等模式植物,鲜有关于玉米磷酸化蛋白质组学的研究报道。已有的关于玉米憐酸化蛋白质组学的研究,研究重点也仅局限在在玉米根系中特定蛋白质的研究上此外,这些研究主要釆用双向电泳的手段研究憐酸化蛋白质,研究者需要投入大量的时间、精力、金钱完成研究工作。随着质谱技术,以及以质谱技术为基础的隣酸化蛋白质富集方法的发展,例如金属氧化物亲和色谱法(MOAC)、固定金属离子亲和色谱法(MAC),高通量的磷酸化蛋白质组学分析方法被应用在人体、动物疾病磷酸化蛋白质组学的研究中。

　　在众多以质谱为基础的憐酸化蛋白质富集方法中,MAC是一种快速、高效、经济的方法。2011年,Bi等采用金属氧化物亲和色谱法从正常的玉米叶中分离得到125种磷酸化蛋白质。然而,并没有研究人员采用MOAC或者IMAC对盐胁迫条件下的玉米憐酸化蛋白质组学进行研究。有研究表明,MOAC和MAC富集得到的憐酸化蛋白质/多肽的种类差异性很大,为了更加全面地了解盐胁迫条件下玉米体内磷酸化进程,需要在玉米磷酸化蛋白质组学的研究中采用MAC的方法,这是因为越多憐酸化蛋白质的发现,将会帮助研究者更好地理解玉米抵抗盐胁迫的生理机制。

　　有研究表明,上样缓冲液的组成对IMAC的富集效果有着重耍的影响。上样缓冲液的组成、pH值等的微小改变都会造成结果的巨大差异。为了提高材料的特异性,上样缓冲液的组成以及IMAC材料基质的选择成为该领域研究的热点。研究表明,一旦非磷酸多肽键合到IMAC材料上,将很难被去除。因此,从源头,即上样过程抑制非憐酸化多肽的键合非常关键。到目前为止,几乎所有采用IMAC富集磷酸化多肽的研究中,都采用不同比例的乙腈和三氟,乙酸混合溶液作为上样缓冲溶液。这是因为诸如三氟乙酸等的强酸可以使含有羧基的酸性多肽发生质子化,从而阻止这种酸性的磷酸化多肽键合到MAC材料上。在实验室合成了一种固定钛离子亲和色谱材料,并对该材料所需的上样缓冲溶液进行了优化,发现80%乙腈、6%三氟乙酸的缓冲溶液效果最佳。如此高比例的乙腈被应用是由于其可以降低MAC材料和非磷酸化多肽之间的疏水相互作用。同时,一些研究也表明在磷酸和乙腈的混合溶液中,改变其中乙腈的含量,磷酸溶液的pH值始终保持稳定。研究表明采用不含乙腈的6%乙酸溶液(pH 3.5), IMAC材料富集磷酸化多肽的效果最。也有一些研究发现,当上样缓冲液中含有高浓度的有机酸,如2,5-二轻基苯甲酸或邻苯二甲fe,可以极大地抑制结果中非憐酸化多肽的数量(Thingholm,2006; Larsen,2005)。这些研究表明当上样缓冲液由高浓度的有机酸如邻苯二甲酸氢钾等组成时,固定金属离子亲和色谱或许将发挥最佳的效果。在前人的研究中,磷酸化修饰的壳聚糖和纤维素被用来作为合成MAC材料的基质材料,然后铁离子被固定作为螯合憐酸化多肽的官能基团。然而,由于壳聚糖和纤维素不能溶解于水溶液中,因此如果在水相中对其进行磷酸化改性时,改性只能发生在表面,反应为非均相的反应。众所周知,聚乙烯醇是一种高水溶性的生物相容性高分.1^物质,而且具有抗非特异性吸附的特点,因此很适合作为憐酸化多肽的富集材鉴于其的水溶性,其与憐酸的均相反应可以在水溶液中进行。另外,由于聚乙烯醇和磷酸反应可以生成凝胶状的物质,因此产物拥有较大的比表面积,也就为后续钛离子的固定提供了更多的位点。

4.固定沉淀剂分子印迹聚合物的应用

　　蛋白质及其复合物、组装体完整三维结构的测定是研究生命活动中分子结构与功能关系,揭示生命现象的物理化学本质的科学基础。蛋白质及其复合物晶体的X-射线衍射是研究生物大分子三维精细结构的最主要的手段之一。在人类基因组全序列测定顺利完成和“后基因组时代”到来之际,生命科学的中心任务是揭示基因组的功能,并在此基础上阐明遗传、发育、进化、功能调控等基本生物学问题,以及进一步解决与医学、环境保护、农业密切相关的问题。由于基因的功能最终总是通过其表达产物-蛋白质来实现的,因此,要了解基因组全部功能活动(包括正常的和异常的),最终也必须回到蛋白质分子上来。

　　蛋白质是很多治疗疾病药物的作用目标,而蛋白质的主要功能则取决于其三维结构。目前,X-射线衍射法是最常用的解析蛋白质三维结构的手段,该方法成功与否取决于是否可以得到高质量的蛋白质单晶。蛋白质结晶过程是蛋白质分子从无序变为有序,从而从溶液中析出成为晶体的过程。为了得到高质量的晶体,主要的手段是控制蛋白质结晶的成核阶段,即蛋白质结晶过程的第一步。有研究表明,可以通过在亚稳定状态下引入异质成核剂达到诱导晶体产生的目的。目前,常用的异质成核剂主要有矿物质、人类毛发、娃等多孔材料、生物玻璃、沸石、聚合物材料。虽然,这些成核剂在一定程度上提高了晶体生长的几率,但是由于其对蛋白质缺乏特异性亲和能力,因此,这些成核剂的成功率低,且随机性大。通过前面的几章的介绍,了解到分子印迹聚合物(MIPS)由于在其合成过_中以待测目标分子或类似物作为模板,之后将该模板洗脱,从而在聚合物表面留有与模板分子完全吻合的空穴因此MIPS对目标分子具有高度地特异性亲和能力,这种特质可能将有助于促进难以结晶的蛋白质产生晶体，在2011年,在蛋白质结晶中引入了 MIPs,由于 MIPs 的介入三种蛋白质结晶的成功率提高了 8-10%。在2012年,Reddy等对比了三种两稀酰胺类的MIPs在蛋白质结晶实验中的表现,发现含有N-轻甲基丙烯酰胺的MIPs在蛋白质结晶实验中效果最佳。

　　众所周知,晶体生长的首要条件即是过饱和状态,在传统的蛋白质结晶研究中,沉淀剂被用来帮助蛋白质达到过饱和状态,沉淀剂可以通过改变蛋白质-溶剂或者蛋白质-蛋白质之间的相互作用,从而有助于蛋白质分子更快的达到过饱和状态。然而,许多重要的蛋白质含有多变的结构域以及连接体,这种多变的结构使得溶液中的蛋白质分子构象千差万别,因此,这些蛋白质很难通过常规的结晶手段得到其高质量的单晶,从而难以充分认识其结构,并了解其作用。为了更好地促进结构灵活多变的重要蛋白质的结晶,在这部分的研究中,开发了另一种新型的分子印迹聚合物来帮助蛋白质晶体产生,在该聚合物中首次最常用的两种沉淀剂,即将硫酸铵和聚乙二醇固定在了分子印迹聚合物中,此种新型的聚合物被命名为piMIPs,即固定沉淀剂分子印迹聚合物,并且按照其上固定沉淀剂种类的不同将其进一步命名为piMIPi(沉淀剂为聚乙二醇)

5.分子印迹薄膜的制备及应用

　　CHt是一种长寿命的温室效应气体,其在大气中的浓度虽然极低,但对温室效应的相对贡献率却达到15%,而且每年有递增0.8%-1.0%的趋势。就全球尺度而言,关于CRt的源主要是天然湿地、稻田、反当动物、化石燃料生产过程、垃圾处理及浅水湖沼。目前分离出的甲焼氧化菌几乎都是专性氧化甲焼的,不能利用其他基质。在甲焼氧化菌的作用下,甲烧经过一系列中间体甲醇、甲K、甲酸被氧化成二氧化碳,而甲烧氧化菌则从这些氧化途径获得能量,并利用中间产物甲醛作为唯一或主要的碳源供自身生长用。虽然土壤CH4氧化仅占全球CH4总汇的10%,但是,CHU氧化微生物在好氧-厌氧交界面处起到了限制土壤CH4向大气排放的作用,因此也是大气CRt的显著的汇。—些研究者通过比较好氧和严格厌氧条件下CH4排放量之间的差异,发现水稻田产生的CH4,平均有80%在排放到大气中之前己被土壤中的甲烧氧化菌所氧化。据估计,土壤中的好氧甲焼氧化菌每年消耗掉30 Tg的CH4,因此，微生物消耗作用不仅限制了许多CH4源的排放量,而且也是大气CH4的非常重要的汇。前对甲院氧化菌的研究主耍有两种不同的途径:第一个途径是使传统的微生物培养技术将甲院氧化菌分离后进行纯培养,然后对甲烧氧化歯进行生理生化遗传学特征研究,针对甲焼氧化歯的独立性状进行菌体阐述,从而发现有特殊应W价值的甲焼氧化菌;第二种途径不需富集培养甲烧氧化歯,主要是对甲综氧化菌进行生态学研究,依靠PCR技术及甲綜氧化菌特异的进化和功能基因的DNA/RNA序列数据摔和PCR (多聚核U酸链式反应技术)技术在一起,使许多分子生态学手段可以直接应用于甲焼氧化菌的研究中,如PCR、16S rRNA、DGGE (变性梯度凝胶电泳技术)、PLFA (磷脂酸分析)、FISH (原位荧光染交法)等。通常认为通过富集培养方法,从纯培养基中获得到的甲焼氧化菌只是环境中甲烧氧化歯的一部分,并不能分离得到所有的甲焼氧化菌。